来源：中华创伤骨科杂志,,22(01):88-92.
生长板是长骨纵向生长的原动力。生长板是生长期骨骼中最为脆弱的区域，创伤、感染、药物、放疗、肿瘤等多种因素均可导致其损伤，进而引起长骨生长发育障碍，包括肢体长度差异和成角畸形等。生长板损伤主要通过手术矫形进行治疗，但手术创伤较大，且疗效有限，亟待寻找有效的方式促进生长板损伤的软骨再生，防止骨性愈合。详细解析生长板损伤修复的细胞和分子机制可为相关生物治疗手段的研发提供理论基础及潜在干预靶点。近年来，软骨组织工程技术的发展为促进软骨再生及生长板损伤修复提供了新的思路。本文就生长板损伤修复机制及治疗方面的进展进行综述。
一、生长板的简介
软骨内成骨是长骨生长的主要方式，包括以下几个紧密连接的步骤：间充质凝集、凝集的间充质细胞成软骨分化形成软骨原基、生长板软骨细胞依次经历增殖及肥大分化，最后发生凋亡或转变为成骨细胞，被骨组织替代。生长板被认为是软骨内成骨的发育中心，其在形态和功能上可分为4个区：静息带、增殖带、前肥大带与肥大带。靠近关节表面的静息带由小的圆形软骨细胞组成，目前认为这些细胞是软骨干细胞或祖细胞的主要来源。静息软骨细胞分化成扁平的软骨细胞，沿着纵轴形成有组织的柱状结构，分泌Ⅱ型胶原（ColⅡ）、聚集蛋白聚糖与其他的基质蛋白。随后软骨细胞体积增大，依次分化为肥大前、肥大软骨细胞，并表达X型胶原）、印度刺猬因子、基质金属蛋白酶13等特异性蛋白，软骨基质逐渐矿化。肥大软骨细胞进而发生凋亡或成骨分化，并伴有矿化软骨的吸收和血管化，最终由骨组织取代[1]。软骨细胞组成的持续动态发育的生长板是骨骼纵向生长的主要区域。人体这一区域最终会发生骨化，导致成年后纵向骨生长停止。
二、生长板损伤及分型
生长板又称骺板，由软骨组成，是长骨中最脆弱与易受损的区域。流行病学数据显示，儿童骨骼损伤中15%~30%累及生长板[2]。其中超过30%的损伤生长板发生骨性修复，常导致肢体长度差异与成角畸形等，造成终身残疾。一般采用Salter-Harris分类（图1）确定生长板损伤的严重程度，并判断预后[3]。该系统将生长板损伤分为5型：Ⅰ型，骨骺分离；Ⅱ型，骨骺分离加干骺端骨折；Ⅲ型，骨骺骨折是骨骺本身内部的骨折；Ⅳ型，全层的生长板、骺端和干骺端骨折；V型，生长板挤压损伤。其中Ⅰ、Ⅱ型损伤（Ⅱ型较为常见，约占30%）未损伤生长板及骨骺的血供，通常会自行痊愈，不会出现肢体的生长问题；其余3种类型的损伤则造成生长板或骨骺血供受损，引发骨性修复，导致长骨生长障碍[4]。
图1
生长板损伤的Salter-Harris分型
三、生长板损伤的动物模型
由于临床上生长板损伤情况复杂且难以实现生长板修复的动态观察，利用合适的动物模型有助于深入理解生长板损伤修复过程与机制及探讨促进愈合、防止生长障碍发生的措施。目前应用较多是小鼠、大鼠与兔的生长板损伤模型。小鼠与大鼠多采用生长板中央钻孔破坏模型，以胫骨近端与股骨远端为主[5,6]。简而言之，在干骺端皮质开窗，通过该窗采用高速牙科钻垂直于生长板方向制作生长板中央区域损伤，不破坏关节表面。兔在生长板损伤修复，尤其是组织工程材料应用方面广泛使用。兔的生长板损伤模型有：手术刀和小刮板切除胫骨近端生长板的内侧部分的胫骨内侧生长板损伤模型[7]与股骨外侧突外侧钻孔的股骨远端生长板外侧部分及干骺端损伤模型[8]。生长板局部切除与全骨骺钻孔的小型猪、羊模型主要用于评价组织工程材料在生长板损伤的应用效果[9,10,11]。
四、生长板损伤的修复机制
（一）生长板损伤的修复过程
长期以来，我们对生长板损伤修复的认知主要来源于相关动物实验。基于大鼠生长板损伤模型的研究，生长板损伤可分为4个时期：炎症期、成纤维期、成骨期与重塑期[6]。与骨折等骨骼损伤修复过程类似，生长板损伤修复首先经历炎症期，包括中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞的浸润及炎性细胞因子/介质如白介素-1(interleukin-1,IL-1)、白介素-8（interleukin-8,IL-8）、中性粒细胞趋化因子-1（CINC-1）、细胞表面黏附分子、趋化因子与肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）等的上调[12]。随后，生长板损伤进入成纤维期，与骨损伤修复过程相似，该阶段中生长板损伤部位出现间充质细胞中的一种中间纤维蛋白——波形蛋白免疫组化阳性的骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）[11]。根据组织学观察，这些细胞形态与骨细胞或软骨细胞不同，可在生长板损伤修复后期分化为骨相关细胞，参与骨或软骨组织形成[13]。成纤维细胞生长因子-2(fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)、血小板衍生生长因子-BB（plateletderivedgrowthfactor-BB,PDGF-BB）及骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticproteins,BMP）相关基因在成纤维期表达上调，提示它们可能参与生长板损伤修复。随着损伤部位间充质细胞分化进入骨小梁组织和(或)软骨组织，生长板损伤修复进入成骨期。该过程中成骨标志基因Runx2、osteocalcin及碱性磷酸酶表达增加，而成软骨相关基因Sox9与ColⅡ表达下调[14]。生长板损伤部位除可见骨小梁和成骨细胞外，还可观察到少量破骨细胞，提示生长板修复阶段发生骨形成与重塑[14]。参与发育阶段成骨调节的BMP、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）等信号也可通过时空特异表达的方式参与调节生长板损伤修复中骨桥的形成与重塑。
(二)生长板损伤相关调控分子
生长板损伤修复过程受到复杂信号网络的精细调控。下面简述其中研究较为透彻的几种典型的调控分子。
TNF-α：利用大鼠生长板损伤模型发现，TNF-α在损伤后1d（炎性期）及25~35d（骨形成与重塑期）时mRNA水平增高，免疫组化显示其在炎性期（损伤1d）中性粒细胞、单核细胞及骨桥形成早期（损伤后8d）成骨细胞、骨细胞中表达，提示其在早期急性炎症及后期骨桥的形成与重塑中发挥作用[12]。进一步研究发现，初始炎症反应时，在损伤生长板中p38活化，使用TNF-α拮抗剂的大鼠p38的活化被阻断，提示TNF-α激活p38MAP激酶。抑制TNF-α可在损伤第8天降低间充质浸润和细胞增殖以及FGF-2的表达，与此一致的是，TNF-α在体外增加了大鼠骨髓MSCs的增殖与迁移。此外，TNF信号通过抑制损伤部位骨细胞分化和骨基质合成，对损伤生长板的骨形成具有抑制作用[15]。TNF-α在生长板损伤修复中发挥的促进MSCs迁移及抑制成骨的作用与相关组织细胞、修复研究中的结果相似[16,17,18]。
PDGF相较于其他形式的PDGF（PDGF-AB,-AA），PDGF-BB对MSCs或间充质前体细胞有更强的趋化作用[19]，且研究发现生长板损伤修复过程中PDGF-BB的表达上调与MSCs浸润一致[12]，提示其可能参与生长板损伤修复中成纤维阶段的调节。PDGF受体损伤后4d在生长板损伤部位浸润的部分间充质细胞表达。通过大鼠生长板损伤模型结合PDGF受体抑制剂——伊马替尼处理发现，抑制PDGF信号导致损伤早期（4d），受损生长板部位局部间充质细胞浸润减少。与对照组相比，抑制剂处理组损伤后14d大鼠损伤部位软骨修复组织、破骨细胞及骨髓均减少。体外实验发现，PDGF-BB可促进骨髓MSCs的迁移，抑制剂可阻断该促迁移作用[20]。与骨形成和损伤修复过程中的作用一致[21,22]，PDGF-BB可通过促进间充质祖细胞浸润，进而促进生长板损伤的软骨或成骨修复反应以及修复组织的重塑。
VEGF：血管生成在软骨内成骨中发挥至关重要作用[23]，且新生血管的生成是生长板损伤部位的"纤维组织"进行骨转化的先决条件[24]。VEGF是一种已知的血管生成关键调控分子，参与两种骨膜内成骨与软骨内成骨过程调节，并参与骨损伤修复[25,26]。大鼠生长板损伤模型中，VEGFmRNA在伤后第1天开始表达，直到损伤后28d；免疫组化显示，VEGF在骨桥组织中持续表达，VEGF受体1则在生长板增殖、肥大软骨细胞与损伤部位局部新生成的骨组织表达，晚期骨桥组织中不表达，提示VEGF可能参与生长板修复过程调节[27]。利用大鼠生长板损伤模型结合VEGF抑制剂-贝伐珠单抗（Bevacizumab）处理发现，抗VEGF处理导致损伤后6、14d生长板损伤部位血管样结构明显减少，14d损伤部位未分化间质组织增加，骨组织减少。此外，生长板损伤引起的胫骨增长率的降低在抗VEGF处理组表现得更为严重[28]。上述结果提示VEGF在生长板损伤部位的血管生成与骨形成以及未损伤部位生长板软骨生长功能调节中发挥重要作用。
BMPs与FGFs：BMPs信号相关分子在骨发育中，尤其是MSCs成骨及成软骨调节发挥重要作用[29]。在生长板损伤修复过程中，BMPs呈现时空依赖性表达模式[30,31]。研究发现BMP-2可协同神经营养因子-3对大鼠生长板损伤后骨桥形成起促进作用[32]。FGFs/FGFRs信号在软骨内成骨过程中发挥重要作用，其中FGFR3是软骨发育与损伤修复的负性调节分子[33]。大鼠生长板损伤模型中发现，FGF-2表达时期与间充质细胞浸润和骨桥组织形成时间一致，主要表达于成纤维反应期和成骨期的间充质细胞及骨衬细胞[12]。FGF-2参与辐照损伤后生长板发育受抑及TNF-α对生长板损伤修复过程的调节作用[15,34]。此外，FGF-2可与MSCs或祖细胞联合应用，促进骨骺损伤修复[35]。这两种信号调节生长板损伤修复的细胞、分子机制尚未阐明。
五、生长板损伤修复措施
生长板损伤后自身修复能力差，不进行外源性干预的情况下难以实现愈合，故目前临床上主要采用肢体延长与材料植入等手术来改善患者生长板损伤导致的骨生长缺陷，包括成角畸形、骨桥形成与双侧肢体不等长等。患者往往在发育期内需要进行多次手术，且效果不佳。针对生长板损伤后骨桥形成这一导致畸形的根本原因，近年来的研究聚焦于研发基于软骨细胞或MSCs的生物治疗方式来防止骨桥形成，促进生长板损伤修复。
利用兔生长板损伤模型，Lee等[7]发现在损伤后或移除骨桥后移植体外扩增的软骨细胞均可缓解生长板受损所致的生长停滞与肢体成角畸形。同样在兔生长板损伤模型中发现，软骨细胞移植可成功地恢复生长板原始形态结构，防止骨桥组织的形成及生长板早期骨化与闭合[36]。尽管软骨细胞移植的概念在生长板损伤中已得到证实，由于软骨的修复能力差，软骨细胞的来源的限制及离体扩增后再植入可能造成软骨损伤等问题，其应用有较大的限制[37]。
MSCs来源广泛且免疫源性低，广泛应用于组织工程研究中。Hui等[38]发现，骨髓、骨膜及脂肪组织分离的MSCs均可防止骨性修复发生，减轻兔生长板损伤所致的肢体成角畸形与长度差异，但给予脂肪组织来源的MSCs不能促使损伤部位形成软骨呈柱状排列的正常生长板结构。Yoshida等[39]发现滑膜干细胞移植至损伤胫骨生长板可减少兔生长板损伤所致的患肢成角畸形。Planka等[8]发现自体与异体MSCs移植均可矫正肢体长度差异以及成角畸形。MSCs与相关生长因子（FGF-2、TGF-β1等）及支架材料（壳聚糖、胶原等）复合可缓解生长板损伤所致的生长发育障碍[9,14,40]。Asen等[41]发现支架复合TGF-β1可促进软骨修复过程中的干细胞的软骨分化及Ⅱ型胶原分泌。负载含IGF-1聚乳酸-乙醇酸[poly(lactic-co-glycolicacid)PLGA]植入生长板损伤区可促进损伤局部的软骨形成[42]。Clark等[43]将骨髓细胞及IGF1的PLGA支架植入兔骨骺损伤区，发现虽不能改善患侧骨骼成角畸形，但增加损伤区软骨生成，降低骨组织生成。
对于生长板损伤修复过程与详细调控机制的研究，有助于防止生长板损伤后骨性修复及骨生长障碍措施的研发。鉴于生长板损伤修复与骨骼发育过程的相似性，从调节生长板发育的分子网络入手，可望清楚解析生长板损伤修复与发育过程的异同，为实现修复过程的精细调控奠定理论基础。
目前基于MSCs的组织工程措施在生长板修复中的应用尚有待于进一步优化。为实现生长板结构与功能更好的恢复，需综合考虑生长板损伤修复的各阶段细胞、分子事件，筛选出最适合的生长因子组合及运用时机，提高植入细胞/组织工程材料的成功率及促软骨生成效率。由于正常软骨内无血管、神经及淋巴管，其自我修复能力极差，如何在不造成软骨进一步损伤的情况下通过原位诱导相关干细胞或前体细胞的功能活性，促进生长板修复是未来的重要研究方向。此外，目前研究多用小动物进行，相关研究成果需要在大动物体中进行验证。
参考文献略
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